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                                                                                               siRNA单基因套装合成

产品简介

针对靶基因设计的siRNA的基因沉默效果不尽相同。一般针对靶基因的不同区域设计三对siRNA,以确保实现靶基因的高效沉默。权阳生物将采用独有的siRNA design技术设计三对靶基因(仅人、小鼠、大鼠)siRNA,保证在标准使用条件下至少?#27426;詓iRNA的mRNA水平沉默效率达70%以上。套餐产品还附送实验所需的阴性对照,阳性对照,及阳性对照引物(仅人、小鼠、大鼠)等。

套装类型

普通siRNA经济型套餐A 优惠价¥1450 普通siRNA实惠套餐B 优惠价¥1650
套餐内容 规格 纯化方式 套餐内容 规格 纯化方式
目的基因siRNA oligos 3对(3×2 OD) HPLC 目的基因siRNA oligos 4对(2×4 OD) HPLC
阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC 阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC
FAM标记阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC FAM标记阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC
      阳性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC
   
化学修饰siRNA经济套餐C 优惠价¥1750 化学修饰siRNA实惠套餐D 优惠价¥2150
套餐内容 规格 纯化方式 套餐内容 规格 纯化方式
目的基因siRNA oligos 3对(3×2 OD) HPLC 目的基因siRNA oligos 4对(4×4 OD) HPLC
阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC 阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC
FAM标记阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC FAM标记阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC
阳性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC 阳性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC
   
荧光修饰siRNA经济套餐E优惠价¥2350 荧光修饰siRNA实惠套餐F 优惠价¥2850
 套餐内容  规格 纯化方式  套餐内容  规格 纯化方式
 目的基因siRNA oligos 3对(3×2 OD) HPLC 目的基因siRNA oligos  4对(4×4 OD) HPLC
 阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC  阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD)   HPLC
FAM标记阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC FAM标记阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC
阳性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC 阳性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC
 
           
in vivo 化学修饰siRNA经济套餐G优惠价¥2650 in vivo 化学修饰siRNA实惠套餐H 优惠价¥3150
(全链甲氧修饰,末端胆固醇修饰) (全链甲氧修饰,末端胆固醇修饰)
 套餐内容  规格 纯化方式  套餐内容  规格 纯化方式
 目的基因siRNA oligos 3对(3×2 OD) HPLC 目的基因siRNA oligos  4对(4×4 OD) HPLC
 阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC  阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD)   HPLC
FAM标记阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC FAM标记阴性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC
阳性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC 阳性对照siRNA oligos 1对(1×1 OD) HPLC
实验方法

siRNA 转染  
A.siRNA转染的方法  
  脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几点
哺乳动物转染的常见方法有:磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法(例如,显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂,其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
  • 转染试剂的用量
  • siRNA的用量 
  • 转染时的细胞密度
  • 转染时的操作顺序 
  • 转染时的操作顺序 
 
  • 细胞与转染试剂/siRNA复合物的温浴的时间
B.Lipofectamin2000 转染试剂  
  Lipofectamin2000的应用领域
选择最适合的转染试剂和转染条件,往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。 Lipofectamin2000适用于核酸的体内和体外操作,可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染,?#37096;?#24212;用于DNA/siRNA 的共转染操作;是一种新型的高效siRNA转染试剂。
  • 原代培养细胞和转化细胞株的基因转染
 
 
  • siRNA高通量转染试验
 
 
 
  • DNA转染;DNA和siRNA的共转染
 
 
 
  • 核酸(siRNA、DNA、RNA)的体内导入试验
 
 
 
  • 贴壁细胞和悬浮细胞转染
   
  Lipofectamin2000 的特点:
  不必更换培养基,操作简便易行,可在半小时内完成操作
  在含血清培养基中?#26448;?#34920;现高转染效率
  细胞毒性低;适用细胞广泛
  即用型试剂,可在含有抗生素的完全培养基中转染
  基于脂?#23454;?#36716;染试剂,确保没有RNAse活性
  □ 可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入
C.Lipofectamin2000适用的细胞类型   
Lipofectamin2000转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如:

HeLa(?#21496;?#37096;癌 细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角 质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎?#19978;?#32500;细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺 癌细胞)、CHO-k1(?#36136;?#21365;巢细胞)和293(腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。
       


D.转染前细胞培养  
  在细胞板上培养细胞?#20445;?#24212;使细胞汇合在24小时内达到70-90%。
  细胞培养用品 表面积(mm2/孔) 细胞密度 培养基(μL /孔)  
  96?#35013;?/td> 50 1.5´104-5.0´104 100μL  
  48?#35013;?/td> 100 3.0´104-1.0´105 200μL  
  24?#35013;?/td> 200 8.0´104-2.0´105 500μL  
  12?#35013;?/td> 401 1.6´105-4.0´105 1.0 mL  
  6?#35013;?/td> 962 3.0´105-8.0´105 2.0 mL  
  35 mm 962 3.0´105-8.0´105 2.0 mL  
  60 mm 2827 1.0´106-2.5´106 6.0 mL  
E.合?#23454;膌ipofectamin2000用量  
  合?#23454;膕iRNA(DNA):lipofetamin2000比例对核酸的高效转染有重要影响;我们推荐的 DNA:lipofetamin2000为1:0.5—1:5(ug:ul),siRNA:lipofectamin2000为 1:0.01-1:0.1(pmol:ul)一般情况下,此范围内都可获得高的转染效率。
细胞培养用品 siRNA/DNA 培养基最终体积 Lipofectamin2000(siRNA/DNA)  
96?#35013;?/td> 5pmol/0.2μg 100μL 0.25μl/0.5μl  
24?#35013;?/td> 20pmol/0.8μg 500μL 1μl /2μl  
12?#35013;?/td> 40 pmol /1.6μg 1 mL 2μl /4μl  
6?#35013;?/td> 100 pmol /4.0μg 2 mL 5μl /10μl  
35 mm 100 pmol /4.0μg 2 mL 5μl /10μl  
60 mm 600 pmol /8.0μg 5 mL 10μl /20μl  
F.贴壁细胞转染程序     
  转染前一天,4-5´104细胞接种在24?#35013;?#19978;, 0.5mL含FBS和抗生素的DMEM(或Opti-MEM,其他培养基)细胞培养基。  
 
  
选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很 2. 选择用于初期接种的细胞数量,应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。  
重要。siRNA(DNA)和lipofectamin的用量和两者的比例可在推荐范围内?#23454;?#35843;整。  
  在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混匀;  
   
    
  混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM,或其他无血清培养基)稀释1μl lipofectamin试剂(DNA转染?#20445;?#21017;加入2μllipofectamin试剂),轻轻混匀,室温放置5分钟;  
 
  
  将稀释好的siRNA和RNAi-Mate试剂混合;轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物。  
 
  
  将100μl siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物加到含有细胞和培养基的培养板的孔中,来回轻柔摇晃细胞培养板板。  
 
  
  7. 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感,孵育4-6小时后,除去复合物,更换培养基。    
G.悬浮细胞转染程序     
  转染的当天,收集细胞离心,用含FBS的培养基重悬。  
 
  
  在50μl的DMEM(或Opti-MEM,或其他无血清培养基)无血清的培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA),柔和混匀;  
 
  
  混匀lipofectamin试剂,用50μl无血清的DMEM或Opti-MEM,或其他无血清培养基)稀释1μl lipofectamin试剂(DNA转染?#20445;?#21017;加入2μl lipofectamin试剂),轻轻混匀,室温放置5分钟;  
 
  
  将稀释好的siRNA和lipofectamin试剂混合;轻柔混匀,室温放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin(或DNA/lipofectamin)复合物。  
 
  
  再加入400μL细胞悬浮?#28023;?#32454;胞数量决定于细胞类型和转染后分析测试的时间)。  
 
  
  6. 细胞在CO2培养箱中37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感,孵育4-6小时后,除去复合物,更换培养基。    
     
     
     
     
     
H.DNA和siRNA共转染细胞  
  在转染的前一天,4-5´104细胞接种在24?#35013;?#19978;,0.5 mL含FBS和抗生素的细胞培养基。
  选择用于初期接种的细胞密度,应能在24小时内使细胞汇合达到70-90%。
  在100μL的无血清的培养基中稀释20pmol siRNA和0.2μg DNA,加入2μl lipofectamin试剂,充分混合,放置20分钟,以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin复合物。
  将siRNA/ DNA/lipofectamin复合物加入培养基中,轻轻混?#21462;?/td>
  5. 细胞在37℃温育24h-48h后,进行转染后的其它步骤。
I.siRNA体内导入方法  
  适量的siRNA或DNA溶于不含RNA酶的无菌水中,轻轻混匀,因为注射液体积有限,建议采用高浓度的siRNA或DNA,一般DNA为2μg /μL、siRNA为10μg /μL。
  取适量的DNA、siRNA或siRNA\DNA复合物与lipofectamin混合。例如,在1#管中加入0.5μL的DNA(1μg)和 0.5μL的siRNA(5μg),在2#管中加入0.55μL的lipofectamin(24μg)和0.45μL不含RNA酶的无菌水中,将1#管 中的溶液加入2#管中,在室温下温育30分钟,以形成siRNA/DNA-lipofectamin复合物。
  3. 制备的siRNA/DNA-lipofectamine复合物可用于体内导入siRNA、DNA或siRNA\DNA。

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